摘要本文主要从以下几部分进行论述：
第一部分：局部应用前列腺素类药物对兔角膜上皮细胞屏障功能的影响
目的：苯扎氯铵(BAK)是滴眼液中最常用的防腐剂之一，大量的临床研究发现，局部长期使用含BAK的眼部制剂会出现很多眼部不适症状。含BAK的前列腺素类药物是治疗开角性青光眼的一线药物，临床上患者往往需要长期使用，易导致眼睛干涩，结膜充血等等，然而其作用机制还不是非常清楚。紧密连接与粘着连接等构成了角膜上皮抵御外界病原微生物入侵的第一道生理屏障，对角膜正常生理功能的维持具有非常重要的作用。本研究拟探讨局部应用前列腺素类药物对角膜上皮细胞屏障功能的影响及其作用机制。
方法：新西兰大白兔被随机的分成4组，每组12只，右眼为药物处理组，分别给以贝美前列腺素(0.005％ BAK)，曲伏前列腺素(0.015％ BAK)，拉坦前列腺素(0.02％ BAK)，以及0.02％ BAK，每日一次，持续30天给药，对侧未处理眼作为空白对照。Schimer实验用以评估用药后泪液分泌的变化，裂隙灯显微镜下观察角膜荧光染色、玫瑰红染色以及BUT。运用活体共聚焦显微镜(IVCM)和苏木素伊红(HE)染色观察角膜上皮细胞层、基质层和内皮细胞层的形态变化。跨膜上皮细胞电阻(TER)评估角膜上皮屏障功能，免疫荧光染色观察紧密连接标志物ZO-1、occludin，粘着连接标志物β-catenin以及细胞增殖标志物ki67在角膜上皮细胞中的定位和表达。TNUEL凋亡试剂盒评估局部用药后的角膜上皮细胞凋亡情况。
结果：药物处理30d后，贝美前列腺素与曲伏前列腺素实验组的泪液分泌，BUT，角膜荧光素与玫瑰红染色与空白对照组相比无显著差异，而在0.02％ BAK与拉坦前列腺素实验组中，泪液分泌减少，BUT缩短，角膜荧光素与玫瑰红染色评分增加。HE染色检测发现，药物处理后，角膜形态无显著变化。IVCM检查证实，与空白对照组相比，不同前列腺素类药物实验组以及BAK处理组，角膜上皮浅表层细胞形态发生明显的变化，细胞体积变大，形态变得不规则，基底层细胞无显著变化。在角膜基质层，与对照组相比，前列腺素实验组与BAK处理组的桥样结构显著增多。与对照组相比，所有实验组的角膜内皮细胞的形态与结构均没有明显改变。在前列腺素类药物实验组，用药5d后， TER呈现BAK浓度依赖性的下降，0.02％ BAK处理组下降最为显著。药物处理5d后， ZO-1和occludin在细胞膜上的分布破坏，而β-catenin的分布无明显变化，用药30d后，ZO-1和occludin以及β-catenin的形态与结构均发生了明显的破坏。ki67在对照组和实验组无明显变化，TUNEL试剂盒检测发现，局部应用前列腺素类药物和BAK后，凋亡的上皮细胞数目明显增多。
结论：局部应用含BAK前列腺素类药物会破坏角膜上皮细胞的屏障功能，进一步揭示了防腐剂BAK诱导眼表毒性的相关机制，为后续防腐剂的相关眼表毒性研究提供了很好的理论依据。
第二部分：防腐剂苯扎氯铵对兔角膜内皮细胞间隙连接细胞通讯的影响及机制研究
目的：在正常生理状态下，角膜内皮间隙连接形成的通道，可让小分子营养物质，信号分子和代谢产物通过，在维持角膜内皮的内环境稳态和新陈代谢中发挥着重要作用，同时角膜内皮形成的屏障可有效阻止房水通过旁细胞通路进入角膜基质，维持基质的相对脱水状态，因而间隙连接与内皮屏障共同维持了角膜的透明和内环境的稳定。BAK是眼科最长用的防腐剂之一，长期使用含有BAK的滴眼液会出现很多眼部不适症状，如干眼，结膜鳞状化生，细胞凋亡等。本研究主要探索局部应用BAK对角膜内皮间隙连接细胞通讯的影响，并对相关机制进行探索。
方法：36只新西兰大白兔被随机的分成三组，右眼为药物处理组，分别给以0.01％ BAK、0.05％ BAK以及0.1％ BAK，每日2次，持续给药7d，对侧未处理眼作为空白对照。活体共聚焦(IVCM)显微镜检测角膜内皮的形态变化，免疫荧光技术检测间隙连接标志物Cx43在细胞中的定位和分布。TUNEL实验检测角膜内皮细胞凋亡情况。Western blot和RT-PCR技术检测Cx43和紧密连接标志物ZO-1的蛋白和基因表达水平。免疫沉淀技术和免疫荧光双染色技术评估Cx43与ZO-1的相互作用。Scrape loading and dye transfer(SLDT)技术分析BAK对间隙连接细胞通讯活性的影响。
结果：局部使用0.05％ BAK和0.1％ BAK，破坏了间隙连接蛋白Cx43以及紧密连接标志物ZO-1在角膜内皮细胞中的分布，同时下调了Cx43的蛋白表达水平。高浓度的BAK诱导Cx43发生磷酸化。免疫荧光共染色和免疫沉淀结果发现，BAK处理7d后，与对照组相比，Cx43与ZO-1的结合发生了破坏，相互作用显著减弱。SLDT实验发现，BAK处理后，间隙连接细胞通讯的活性（GJIC activity）显著受到抑制。
结论：BAK通过磷酸化Cx43，破坏Cx43与ZO-1的相互作用，下调Cx43的蛋白表达水平，从而破坏角膜内皮细胞的间隙连接细胞通讯。本研究第一次探讨了BAK对角膜内皮细胞间隙连接细胞通讯的影响，为眼科临床如何合理用药提供了一定的理论依据。
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